HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY / HPLC

 ( KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI )

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) merupakan jenis khusus dari kromatografi kolom. Namun perbedaannya adalah kromatografi ini menggunakan cairan dengan tekanan tinggi sebagai fase gerak, kolom yang digunakan pendek untuk mempersingkat waktu, dan diameter kolom sempit antara 1 sampai 3 mm sehingga memiliki kepekaan yang tinggi.

 Kromatografi ini paling banyak digunakan digunakan baik pada laboratorium penelitian, maupun laboratorium pengawasan mutu di industri farmasi dan makanan, untuk penetapan kadar senyawa non atsiri dan senyawa yang memiliki bobot molekul tinggi dari campuran dengan senyawa-senyawa lain tanpa dilakukan pemisahan terlebih dahulu.

 Instrumentasi

-       Sama seperti halnya pada GC, pada HPLC sampel diinjeksikan melalui injektor yang kemudian oleh fase gerak berupa campuran pelarut di bawa ke dalam kolom dan terjadi pemisahan. Hasil pemisahan ini akan dideteksi oleh suatu detektor dan diperkuat oleh amplifier dan dicatat oleh recorder berupa kromatogram.

-       Instrumen HPLC terdiri dari 2 atau lebih wadah yang berisi pelarut murni (fase gerak), wadah pencampuran pelarut, pompa yang disertai pengatur tekanan untuk mengalirkan fase gerak, injektor, kolom pemisahan, detektor, penguat dan recorder.

A. Fase Gerak

-   Fase gerak pada HPLC berupa cairan, yaitu campuran dari 2 atau lebih pelarut, sehingga dapat terjadi pemisahan zat-zat dalam campuran senyawa berdasarkan koefisien partisi dari zat-zat dalam campuran senyawa tersebut dalam pelarut.

-   Pada jenis HPLC yang klasik, kita hanya dapat memisahkan zat-zat dalam campuran senyawa dengan hanya menggunakan satu komposisi campuran pelarut selama terjadinya elusi. Namun dengan perkembangan teknologi, pada jenis HPLC terbaru, pemisahan zat-zat dalam campuran senyawa dapat dilakukan dengan berbagai komposisi campuran pelarut selama terjadinya elusi.

-   Pada HPLC jenis terbaru ini, digunakan metode dimana selama pengelusian komposisi pelarut dapat diubah-ubah. Pelarut-pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak, masing-masing ditempatkan dalam tiap-tiap wadah dalam keadaan murni, kemudian pelarut-pelarut murni tersebut akan dialirkan ke dalam wadah pencampur yang komposisinya bisa diatur dalam ukuran waktu, kemudian dipompakan dengan tekanan 6000 – 10000 psi ke dalam kolom pemisah. Setelah melewati kolom pemisah fase gerak ini akan keluar kembali dan ditampung dalam suatu wadah pembuangan. Metode ini dinamakan elusi gradien.   

B.  Injektor

-   Sampel yang akan dipisahkan dan ditentukan kadarnya harus berupa larutan, dan bila sampel tersebut berupa padatan harus dilarutkan terlebih dahulu.   

-   Sampel berupa campuran senyawa yang akan dipisahkan dan ditentukan kadarnya dimasukkan ke dalam lubang injektor pada suhu kamar.

-   Sampel yang akan diinjeksikan harus disaring dahulu dengan penyaring milliphore dengan ukuran  biasanya 0,45 –0,5 mm yang dipasang pada spuit injeksi.

-   Sampel yang diinjeksikan biasanya antara 100 – 1000 mg/ml dengan volume yang dinjeksikan 20ml.

C. Kolom Pemisah

-   Kolom pemisah ini berfungsi untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran senyawa berdasarkan sistem penjerapan oleh zat padat atau sistem partisi permukaan zat cair yang terdapat pada zat padat.

-   Tergantung dari kepolaran fase diam terhadap fase gerak, dikenal 2 sistem kromatografi dalam HPLC, yaitu :

1.      Kromatografi fase normal, kromatografi dimana fase diamnya lebih polar daripada fase geraknya.

2.      Kromatografi fase terbalik, kromatografi dimana fase geraknya lebih polar daripada fase diam.

-   Sebagian besar bahan kolom yang digunakan  didasarkan pada silika, dimana permukaan silika ini terdiri dari gugus hidroksil yang terikat pada silikon.

-   Ukuran partikel kolom biasanya berkisar antara 3 sampai 10 mm.

-   Banyak jenis-jenis kolom yang digunakan pada HPLC dihasilkan dengan cara memodifikasi secara kimia gugus hidroksil permukaan pada silika. 

D.    Detektor

-   Detektor berfungsi untuk mendeteksi senyawa-senyawa yang terpisah dan mengubahnya menjadi isyarat listrik, sehingga dapat diterjemahkan oleh recorder.

-   Detektor yang digunakan pada HPLC sebagian besar adalah spektrofotometer yang mendeteksi pada panjang gelombang tertentu, dimana pada panjang gelombang tersebut pelarut sedikit sekali atau tidak sama sekali menyerap sinar, sedangkan senyawa yang dipisahkan dapat menyerap sinar dengan kuat.

-   Kebanyak detektor menggunakan sinar ultraviolet dan kadang-kadang fluoresensi.

-   Macam-macam detektor

1.      Detektor ultra violet (UV)

-   Detektor ini paling banyak digunakan, dan hanya dapat digunakan untuk zat yang dapat menyerap sinar UV

-   Ada 2 jenis dasar detektor UV, yaitu :

1.   Detektor UV dengan satu panjang gelombang, biasanya 254 nm, yang dapat diubah ke panjang gelombang lain dengan mengubah monokromator dan sumber sinar.

2.   Detektor dengan panjang gelombang yang dapat diubah-ubah, dengan panjang gelombang antara 190 – 700 nm.

-   Detektor biasanya memiliki jangka kepekaan yang lebar misalnya 10 tingkat atau lebih, dari 0,001;  0,002; sampai 0,2 AUFS (Absorption Unit Full Scale)

2.   Detektor Fluoresensi     

-   Sebenarnya detektor yang paling peka adalah detektor fluoresensi, namun detektor ini hanya dapat digunakan untuk zat yang berfluoresensi saja.

3.   Detektor elektrokimia

-   Detektor hanya digunakan berdasarkan sifat redoks dari zat yang dipisahkan.

4.   Detektor indeks bias

-   Detektor ini bekerja berdasarkan perbedaan indeks bias antara pelarut murni sebelum mengelusi dan indeks bias pelarut setelah mengelusi zat.

-   Detektor ini tidak dapat digunakan untuk metode elusi gradien, karena komposisi pelarut akan berubah-rubah selama pengelusian.

5.   Detektor Spektrometri infra merah

E.  Penguat dan Pencatat

-   Penguat (amplifier) adalah alat yang digunakan untuk memperkuat respon yang dideteksi oleh detektor

-   Pencatat (recorder) adalah alat yang digunakan untuk menerjemahkan isyarat listrik yang berasal dari suatu detektor, biasanya berupa alat pencetak.

-   Hasil cetakan dari recorder berupa puncak-puncak yang dinamakan kromatogram.

 Analisis Kualitatif dan Kuantitatif

A. Analisis Kualitatif

-   HPLC  dapat digunakan untuk analisis kualitatif suatu senyawa tertentu.

-   Sama seperti halnya kromatografi gas metode ini jarang digunakan untuk analisis kualitatif, karena tidak sebaik dengan instrumen spektofotometer IR, maupun spektrofotometer NMR.

-   Untuk identifikasi suatu senyawa dengan HPLC, maka kolom dan semua variabel lainnya, seperti, komposisi fase gerak dan laju aliran fase gerak (F) harus dapat dikendalikan dengan seksama.

-   Dengan mengendalikan semua variabel tersebut, maka waktu retensi (t_R) dan volume retensi (V_R) suatu zat akan merupakan sifat khas dari zat tersebut.

-   Waktu retensi (t_R) adalah waktu sejak sampel diinjeksikan hingga munculnya pita elusi pada pencatat.

-       Volume retensi (V_R) adalah hasil perkalian antara waktu retensi dengan laju aliran fase gerak

                                          V_R = t_R  X   F

-   Sama seperti halnya pada kromatografi gas, pada HPLC,  posisi pita-pita elusi pada sumbu horizontal kromatogram dan lebar pita-pita tersebut akan menentukan sempurna atau tidaknya suatu pemisahan campuran senyawa.

-   Pemisahan (R) dua komponen dalam suatu senyawa didefinisikan dengan rumus dibawah ini.

                                                  2 (t_R2   -   t_R1)

                                      R   =   -------------------

                                                  w_b1    +   w_b2

     atau jika lebar pita diukur setengah tinggi antara garis dasr dan puncak, maka persamaannya menjadi

                                                           2 (t_R2   -   t_R1)

                                      R   =   -------------------------------

                                                  1,699 (w_{1/2 1}    +   w_{1/2 2})

     Jika R = 1,5,  kedua zat terlarut tersebut dikatakan terpisahkan

            R = 1,  pemisahan cukup memadai untuk analisis

            R < 1, pemisahan dua zat tersebut buru

 B.    Analisis kuantitatif

HPLC  merupakan instrumen yang sangat baik untuk analisis kuantitatif suatu komponen zat dalam campuran.

-   Penentukan kadar suatu zat dalam campuran suatu senyawa dengan HPLC, sama seperti pada        kromatografi gas yaitu dengan mengukur luas daerah di bawah pita elusi dari zat yang akan ditentukan kadarnya pada kromatogram, kemudian dibandingkan dengan luas daerah di bawah pita suatu larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya atau dengan membuat kurva kalibrasi dari serangkaian larutan standar.

                                          A zat        

                        C zat  =  ------------   x     C standar

                                       A standar

     C zat          = konsentrasi zat sampel (ppm)

     C standar   = konsentrasi standar (ppm)

     A zat         = luas daerah zat sampel

     A standar = luas daerah standar

-   Daerah dibawah pita tersebut dihitung luasnya seperti segitiga, yaitu :

                                    Luas = ½ (Alas  x Tinggi)

-   Namun dengan perkembangan teknologi digital, dengan instrumen terbaru yang dilengkapi dengan komputer, kita tidak perlu lagi menghitung luas daerah dibawah pita, baik pada komponen zat, maupun larutan standar, karena komputer sudah menghitung secara langsung dari detektor.

-   Zat-zat yang dapat ditentukan kadarnya secara HPLC adalah zat non atsiri dan zat yang memiliki bobot molekul tinggi.