Minggu, 05 Juni 2011

knowledge: HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY / HPLC ( KR...

knowledge: HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY / HPLC ( KR...: "HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY / HPLC ( KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI ) Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) merupakan jeni..."
GAS CHROMATOGRAPHY / GC
 ( KROMATOGRAFI GAS )

         Kromatografi gas yaitu kromatografi dimana pemisahannya didasarkan atas partisi dan adsorpsi zat   yang akan dianalisis dalam bentuk gas antara dua fase (fase gerak dan fase diam)
          Berdasarkan jenis fase diam, ada 2  jenis kromatografi gas (KG) :
1. Kromatografi Gas Padat (KGP)
Berdasarkan penjerapan (adsorpsi) zat dalam bentuk gas pada permukaan padat . Sekarang jarang digunakan.
2. Kromatografi Gas Cair (KGC)
Berdasarkan partisi zat dalam bentuk gas dalam fase diam (cairan yang tersalut pada zat padat) dengan fase gerak (gas). Paling banyak dipakai.
-       Keuntungan utama kromatografi gas adalah waktu analisis yang singkat dan ketajaman pemisahannya besar.
-       Syarat utama zat yang dapat dianalisis secara KG adalah zatnya harus mudah menguap (titik didih rendah / tekanan uap tinggi) atau dapat diubah menjadi zat yang mudah menguap.

   Instrumentasi
-       Instrumen kromatografi gas terdiri dari tabung gas pembawa (fase gerak), injektor, kolom pemisah (fase diam), detektor, amplifier, dan recorder.
-       Bagan lengkap instrumen kromatografi gas dapat dilihat pada gambar di bawah ini.




A. Gas pembawa
-   Tabung gas pembawa ini berfungsi sebagai wadah gas pembawa yang dilengkapi dengan pengatur tekanan.
-   Sebagai gas pembawa (fase gerak) yang banyak digunakan adalah gas hidrogen, nitrogen, helium, dan argon  
-   Hidrogen memiliki keuntungan, yaitu karena viskositasnya yang rendah, dalam kolom pemisah yang panjang masih dapat mencapai kecepatan aliran yang optimal.
-   Pemilihan gas pembawa disesuaikan dengan kolom pemisah dan detektor yang digunakan.

Gas Pembawa
Detektor
Hidrogen
Thermal Conductivity Detector (TCD)
Helium
Thermal Conductivity Detector (TCD)
Flame Ionization Detector (FID)
Flame Photometric Detektor (FPD)
Electron Capture Detector (ECD)

Nitogen
Thermal Conductivity Detector (TCD)
Flame Ionization Detector (FID)
Flame Photometric Detektor (FPD)
Electron Capture Detector (ECD)
Hall Electrolytic Conductivity Detector
Photo Ionization Detector (PID)
Argon
Flame Ionization Detector (FID)
Argon + Metana
Electron Capture Detector (ECD)

B.  Injektor
-   Injektor merupakan bagian yang digunakan untuk memasukkan sampel yang akan dipisahkan.
-   Pada bagian ini sampel cair akan dipanaskan, sehingga menguap dengan cepat.
-   Sampel cair yang digunakan biasanya 10-20 mikroliter.
-   Penyuntikan sampel harus berlangsung cepat dan butuh suatu latihan, karena bila penyuntikan lambat maka akan diperoleh pita yang melebar atau lebih banyak dari yang diperlukan.
-   Suhu pada tempat injeksi sangat penting, bila sampel cair menguap lambat, maka hasilnya juga akan diperoleh pita yang lebih banyak. Biasanya suhu yang digunakan sedikit di atas titik didih komponen sampel.



                                      Gambar lubang injeksi sampel

C. Kolom pemisah
-   Kolom pemisah berfungsi sebagai fase diam yang dapat memisahkan campuran suatu senyawa.
-   Ada 2 jenis kolom pemisah, yaitu kolom kemas dan kolom kapiler. Kolom kemas memiliki diameter internal  2-4 mm dengan panjang 1 -3 m.. Sedangkan kolom kapiler memiliki internal diameter 0,02-0,2 mm dan   panjang 15-25 m.
-   Kolom pemisah biasanya berupa material padat inert (contoh tanah diatomae) yang disalut dengan suatu cairan yang sebenarnya berfungsi sebagai fase diam.
-   Syarat cairan fase diam → harus melarutkan sampel sampai taraf tertentu. Pemisahan terjadi secara partisi antara fase diam (cairan) dengan fase gerak (gas).
-   Kolom ini berada dalam suatu pemanas yang suhunya dibuat konstan dengan thermostate.
-   Kolom  sangat beragam dalam hal ukuran dan bahan pengemasnya. Namun yang lazim digunakan, yaitu memiliki panjang 2 meter dan diameter 6 mm yang terbuat dari pipa tembaga atau baja tahan karat. Untuk menghemat ruangan pipa tersebut dibuat bentuk U atau dikumpar menjadi spiral. Pipa tersebut diisi dengan serbuk bahan padat sehingga luas permukaannya besar dan relatif lamban, biasanya digunakan tanah diatomae. Serbuk padat ini sebenarnya hanya sebagai penopang mekanis untuk cairan yang membasahi serbuk tersebut yang merupakan fase diam sebenarnya.

Jenis sampel
Fase Diam
Hidrokarbon Alifatik
Apiezon L, Minyak metil silikon
Hidrokarbon aromatik
Fenil/metil silikon
Alkohol, poliol
Carbowax (PEG)
Karbohidrat
Sianosilikon
Asam karboksilat
Carbowax
Ester
Gom metil silikon
Fenol
Minyak metil silikon
Amina
Carbowax + KOH
Steroid
Gom metil silikon, Dexil








D. Detektor
-   Alat yang dapat mendeteksi senyawa yang terpisah dalam gas pembawa dan merubahnya menjadi isyarat listrik yang proporsional.
-   Detektor harus memiliki karakteristik berikut ini :
1.      Kepekaan yang tinggi
2.      Kestabilan tinggi
3.      Respon detektor linier terhadap jumlah sampel yang diukur
4.      Dapat memberikan respon terhadap senyawa kimia apapun
5.      Memiliki waktu respon yang cepat
6.      Zat yang akan dideteksi tidak terurai pada waktu dideteksi.
-   Jenis detektor pada kromatografi gas yaitu :
1.      Flame Ionization Detector (FID/Detektor Pengionan Nyala)
Detektor ini memberikan respons terhadap hantaran oleh ion-ion gas yang dihasilkan oleh eksitasi termal dalam suatu nyala. Detektor ini memiliki respon yang lebih cepat dari pada detektor konduktivitas termal.
2.      Thermal Conductor Detector (TCD/ Detektor konduktivitas termal)
Detektor ini isyarat listriknya bergantung kepada kemampuan gas yang mengalir melewatinya dalam menghantarkan panas.
3.      Electron Capture detector (ECD)
Detektor ini memberikan respon berdasarkan daya tangkap sampel terhadap elektron dari gas yang terionkan, sehingga mengurangi arus listrik
4.      Flame Photometric Detector (FPD/Detektor Fotometri Nyala)
5.      Hall Electrolytic Conductivity Detector (HECD/ Detektor elektrolitik)

E.  Amplifier (Penguat)
 Alat yang digunakan untuk memperkuat respon yang dideteksi oleh detektor

F. Recorder (Pencatat)
-   Alat yang digunakan untuk menerjemahkan isyarat listrik yang berasal dari suatu detektor, biasanya berupa alat pencetak.
-   Hasil cetakan dari recorder berupa puncak-puncak yang dinamakan kromatogram.

 Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
A. Analisis Kualitatif
-   Kromatografi gas dapat digunakan untuk analisis kualitatif suatu senyawa tertentu.
-   Namun analisis kualitatif dengan metode ini jarang digunakan, karena tidak sebaik dengan instrumen spektofotometer IR, maupun spektrofotometer NMR.
-   Untuk identifikasi suatu senyawa dengan kromatografi gas, maka kolom dan semua variabel lainnya, seperti suhu dan laju aliran gas (F) harus dapat dikendalikan dengan seksama.
-   Dengan mengendalikan semua variabel tersebut, maka waktu retensi (tR) dan volume retensi (VR) suatu zat akan merupakan sifat khas dari zat tersebut.
-   Waktu retensi (tR) adalah waktu sejak sampel diinjeksikan hingga munculnya pita elusi pada pencatat.
-       Volume retensi (VR) adalah hasil perkalian antara waktu retensi dengan laju aliran gas.
                                          VR = tR  X   F


                                                Gambar kromatogram kromatografi gas

-   Pada umumnya posisi pita-pita elusi pada sumbu horizontal kromatogram dan lebar pita-pita tersebut akan menentukan sempurna atau tidaknya suatu pemisahan campuran senyawa.
-   Pemisahan (R) dua komponen dalam suatu senyawa didefinisikan dengan rumus dibawah ini.
                                                  2 (tR2   -   tR1)
                                      R   =   -------------------
                                                  wb1    +   wb2
     atau jika lebar pita diukur setengah tinggi antara garis dasr dan puncak, maka persamaannya menjadi
                                                           2 (tR2   -   tR1)
                                      R   =   -------------------------------
                                                  1,699 (w1/2 1    +   w1/2 2)

     Jika R = 1,5,  kedua zat terlarut tersebut dikatakan terpisahkan
            R = 1,  pemisahan cukup memadai untuk analisis
            R < 1, pemisahan dua zat tersebut buruk
-   Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada kromatogram dari dua komponen senyawa dalam campuran.

B.    Analisis kuantitatif
-   Kromatografi gas merupakan instrumen yang sangat baik untuk analisis kuantitatif suatu komponen zat dalam campuran.
-   Penentukan kadar suatu zat dalam campuran suatu senyawa dengan kromatografi gas yaitu dengan mengukur luas daerah di bawah pita elusi dari zat yang akan ditentukan kadarnya pada kromatogram, kemudian dibandingkan dengan luas daerah di bawah pita suatu larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya atau dengan membuat kurva kalibrasi dari serangkaian larutan standar.
                                          A zat        
                        C zat  =  ------------   x     C standar
                                       A standar
     C zat          = konsentrasi zat sampel (ppm)
     C standar   = konsentrasi standar (ppm)
     A zat         = luas daerah zat sampel
     A standar = luas daerah standar
-   Daerah dibawah pita tersebut dihitung luasnya seperti segitiga, yaitu :

                                    Luas = ½ (Alas  x Tinggi)
-   Namun dengan perkembangan teknologi digital, dengan iinstrumen kromatografi gas terbaru yang dilengkapi dengan komputer, kita tidak perlu lagi menghitung luas daerah dibawah pita, baik pada komponen zat, maupun larutan standar, karena komputer sudah menghitung secara langsung dari detektor.
-   Zat-zat yang dapat ditentukan kadarnya secara kromatografi gas, antara lain zat yang mudah menguap, seperti etanol, metanol, aseton, dan minyak atsiri.

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY / HPLC
 ( KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI )

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) merupakan jenis khusus dari kromatografi kolom. Namun perbedaannya adalah kromatografi ini menggunakan cairan dengan tekanan tinggi sebagai fase gerak, kolom yang digunakan pendek untuk mempersingkat waktu, dan diameter kolom sempit antara 1 sampai 3 mm sehingga memiliki kepekaan yang tinggi.
 Kromatografi ini paling banyak digunakan digunakan baik pada laboratorium penelitian, maupun laboratorium pengawasan mutu di industri farmasi dan makanan, untuk penetapan kadar senyawa non atsiri dan senyawa yang memiliki bobot molekul tinggi dari campuran dengan senyawa-senyawa lain tanpa dilakukan pemisahan terlebih dahulu.

 Instrumentasi
-       Sama seperti halnya pada GC, pada HPLC sampel diinjeksikan melalui injektor yang kemudian oleh fase gerak berupa campuran pelarut di bawa ke dalam kolom dan terjadi pemisahan. Hasil pemisahan ini akan dideteksi oleh suatu detektor dan diperkuat oleh amplifier dan dicatat oleh recorder berupa kromatogram.
-       Instrumen HPLC terdiri dari 2 atau lebih wadah yang berisi pelarut murni (fase gerak), wadah pencampuran pelarut, pompa yang disertai pengatur tekanan untuk mengalirkan fase gerak, injektor, kolom pemisahan, detektor, penguat dan recorder.

A. Fase Gerak
-   Fase gerak pada HPLC berupa cairan, yaitu campuran dari 2 atau lebih pelarut, sehingga dapat terjadi pemisahan zat-zat dalam campuran senyawa berdasarkan koefisien partisi dari zat-zat dalam campuran senyawa tersebut dalam pelarut.
-   Pada jenis HPLC yang klasik, kita hanya dapat memisahkan zat-zat dalam campuran senyawa dengan hanya menggunakan satu komposisi campuran pelarut selama terjadinya elusi. Namun dengan perkembangan teknologi, pada jenis HPLC terbaru, pemisahan zat-zat dalam campuran senyawa dapat dilakukan dengan berbagai komposisi campuran pelarut selama terjadinya elusi.
-   Pada HPLC jenis terbaru ini, digunakan metode dimana selama pengelusian komposisi pelarut dapat diubah-ubah. Pelarut-pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak, masing-masing ditempatkan dalam tiap-tiap wadah dalam keadaan murni, kemudian pelarut-pelarut murni tersebut akan dialirkan ke dalam wadah pencampur yang komposisinya bisa diatur dalam ukuran waktu, kemudian dipompakan dengan tekanan 6000 – 10000 psi ke dalam kolom pemisah. Setelah melewati kolom pemisah fase gerak ini akan keluar kembali dan ditampung dalam suatu wadah pembuangan. Metode ini dinamakan elusi gradien.   

B.  Injektor
-   Sampel yang akan dipisahkan dan ditentukan kadarnya harus berupa larutan, dan bila sampel tersebut berupa padatan harus dilarutkan terlebih dahulu.   
-   Sampel berupa campuran senyawa yang akan dipisahkan dan ditentukan kadarnya dimasukkan ke dalam lubang injektor pada suhu kamar.
-   Sampel yang akan diinjeksikan harus disaring dahulu dengan penyaring milliphore dengan ukuran  biasanya 0,45 –0,5 mm yang dipasang pada spuit injeksi.
-   Sampel yang diinjeksikan biasanya antara 100 – 1000 mg/ml dengan volume yang dinjeksikan 20ml.

C. Kolom Pemisah
-   Kolom pemisah ini berfungsi untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran senyawa berdasarkan sistem penjerapan oleh zat padat atau sistem partisi permukaan zat cair yang terdapat pada zat padat.
-   Tergantung dari kepolaran fase diam terhadap fase gerak, dikenal 2 sistem kromatografi dalam HPLC, yaitu :
1.      Kromatografi fase normal, kromatografi dimana fase diamnya lebih polar daripada fase geraknya.
2.      Kromatografi fase terbalik, kromatografi dimana fase geraknya lebih polar daripada fase diam.
-   Sebagian besar bahan kolom yang digunakan  didasarkan pada silika, dimana permukaan silika ini terdiri dari gugus hidroksil yang terikat pada silikon.
-   Ukuran partikel kolom biasanya berkisar antara 3 sampai 10 mm.
-   Banyak jenis-jenis kolom yang digunakan pada HPLC dihasilkan dengan cara memodifikasi secara kimia gugus hidroksil permukaan pada silika. 

D.    Detektor
-   Detektor berfungsi untuk mendeteksi senyawa-senyawa yang terpisah dan mengubahnya menjadi isyarat listrik, sehingga dapat diterjemahkan oleh recorder.
-   Detektor yang digunakan pada HPLC sebagian besar adalah spektrofotometer yang mendeteksi pada panjang gelombang tertentu, dimana pada panjang gelombang tersebut pelarut sedikit sekali atau tidak sama sekali menyerap sinar, sedangkan senyawa yang dipisahkan dapat menyerap sinar dengan kuat.
-   Kebanyak detektor menggunakan sinar ultraviolet dan kadang-kadang fluoresensi.
-   Macam-macam detektor
1.      Detektor ultra violet (UV)
-   Detektor ini paling banyak digunakan, dan hanya dapat digunakan untuk zat yang dapat menyerap sinar UV
-   Ada 2 jenis dasar detektor UV, yaitu :
1.   Detektor UV dengan satu panjang gelombang, biasanya 254 nm, yang dapat diubah ke panjang gelombang lain dengan mengubah monokromator dan sumber sinar.
2.   Detektor dengan panjang gelombang yang dapat diubah-ubah, dengan panjang gelombang antara 190 – 700 nm.
-   Detektor biasanya memiliki jangka kepekaan yang lebar misalnya 10 tingkat atau lebih, dari 0,001;  0,002; sampai 0,2 AUFS (Absorption Unit Full Scale)
2.   Detektor Fluoresensi     
-   Sebenarnya detektor yang paling peka adalah detektor fluoresensi, namun detektor ini hanya dapat digunakan untuk zat yang berfluoresensi saja.
3.   Detektor elektrokimia
-   Detektor hanya digunakan berdasarkan sifat redoks dari zat yang dipisahkan.
4.   Detektor indeks bias
-   Detektor ini bekerja berdasarkan perbedaan indeks bias antara pelarut murni sebelum mengelusi dan indeks bias pelarut setelah mengelusi zat.
-   Detektor ini tidak dapat digunakan untuk metode elusi gradien, karena komposisi pelarut akan berubah-rubah selama pengelusian.
5.   Detektor Spektrometri infra merah

E.  Penguat dan Pencatat
-   Penguat (amplifier) adalah alat yang digunakan untuk memperkuat respon yang dideteksi oleh detektor
-   Pencatat (recorder) adalah alat yang digunakan untuk menerjemahkan isyarat listrik yang berasal dari suatu detektor, biasanya berupa alat pencetak.
-   Hasil cetakan dari recorder berupa puncak-puncak yang dinamakan kromatogram.

 Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
A. Analisis Kualitatif
-   HPLC  dapat digunakan untuk analisis kualitatif suatu senyawa tertentu.
-   Sama seperti halnya kromatografi gas metode ini jarang digunakan untuk analisis kualitatif, karena tidak sebaik dengan instrumen spektofotometer IR, maupun spektrofotometer NMR.
-   Untuk identifikasi suatu senyawa dengan HPLC, maka kolom dan semua variabel lainnya, seperti, komposisi fase gerak dan laju aliran fase gerak (F) harus dapat dikendalikan dengan seksama.
-   Dengan mengendalikan semua variabel tersebut, maka waktu retensi (tR) dan volume retensi (VR) suatu zat akan merupakan sifat khas dari zat tersebut.
-   Waktu retensi (tR) adalah waktu sejak sampel diinjeksikan hingga munculnya pita elusi pada pencatat.
-       Volume retensi (VR) adalah hasil perkalian antara waktu retensi dengan laju aliran fase gerak
                                          VR = tR  X   F

-   Sama seperti halnya pada kromatografi gas, pada HPLC,  posisi pita-pita elusi pada sumbu horizontal kromatogram dan lebar pita-pita tersebut akan menentukan sempurna atau tidaknya suatu pemisahan campuran senyawa.
-   Pemisahan (R) dua komponen dalam suatu senyawa didefinisikan dengan rumus dibawah ini.
                                                  2 (tR2   -   tR1)
                                      R   =   -------------------
                                                  wb1    +   wb2
     atau jika lebar pita diukur setengah tinggi antara garis dasr dan puncak, maka persamaannya menjadi
                                                           2 (tR2   -   tR1)
                                      R   =   -------------------------------
                                                  1,699 (w1/2 1    +   w1/2 2)

     Jika R = 1,5,  kedua zat terlarut tersebut dikatakan terpisahkan
            R = 1,  pemisahan cukup memadai untuk analisis
            R < 1, pemisahan dua zat tersebut buru

 B.    Analisis kuantitatif

HPLC  merupakan instrumen yang sangat baik untuk analisis kuantitatif suatu komponen zat dalam campuran.
-   Penentukan kadar suatu zat dalam campuran suatu senyawa dengan HPLC, sama seperti pada        kromatografi gas yaitu dengan mengukur luas daerah di bawah pita elusi dari zat yang akan ditentukan kadarnya pada kromatogram, kemudian dibandingkan dengan luas daerah di bawah pita suatu larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya atau dengan membuat kurva kalibrasi dari serangkaian larutan standar.
                                          A zat        
                        C zat  =  ------------   x     C standar
                                       A standar
     C zat          = konsentrasi zat sampel (ppm)
     C standar   = konsentrasi standar (ppm)
     A zat         = luas daerah zat sampel
     A standar = luas daerah standar
-   Daerah dibawah pita tersebut dihitung luasnya seperti segitiga, yaitu :

                                    Luas = ½ (Alas  x Tinggi)

-   Namun dengan perkembangan teknologi digital, dengan instrumen terbaru yang dilengkapi dengan komputer, kita tidak perlu lagi menghitung luas daerah dibawah pita, baik pada komponen zat, maupun larutan standar, karena komputer sudah menghitung secara langsung dari detektor.
-   Zat-zat yang dapat ditentukan kadarnya secara HPLC adalah zat non atsiri dan zat yang memiliki bobot molekul tinggi.